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Autor: Admin
Puntos de vista: 8
Hora: 21:38:07 | 1 año hace

10.5. Aislamiento de ADN de plásmido

  • La resuspensión del sedimento bacteriano en una solución isotónica. en este solución, la lisis celular aún no tiene lugar. etileno diamina tetraacetato (EDTA) contenida en la resuspensión inhibe la actividad nucleasa de enzimas celulares por complejación Mg 2 + iones. Algunos protocolos anteriores también lisozima aplica para romper la pared celular bacteriana. Además de por encima de los componentes enumerados, la solución de resuspensión puede contener también RNasa enzima con el fin de descomponer los ácidos ribonucleicos que se liberan a continuación, en lisado.

  • lisis alcalina de las células mediante la aplicación de una solución alcalina de sodio dodecil sulfato (SDS), que se desintegra la estructura lipídica de la célula membrana. Además, este tratamiento desnaturaliza las proteínas y el ADN, y mantener estas moléculas disueltas en su desnaturalizado.

  • La precipitación de proteínas disueltas, restos de membrana asociada El ADN genómico mediante la aplicación de una solución de acetato de potasio de ácido. la sal de potasio de sulfato de dodecil también es insoluble. Por lo tanto, este componente también precipitar. El ADN del plásmido todavía ser disuelto durante este paso.

  • La sedimentación de los componentes precipitó en una microcentrífuga. la claro sobrenadante contendrá el plásmido de ADN.

  • de purificación de ADN plásmido utilizando una mezcla de fenol y cloroformo (cuidado Se debe tener cuidado al trabajar con fenol Es corrosivo para la salud humana tejidos). Para extraer el contenido de proteína de las preparaciones de ácidos nucleicos, una mezcla se utiliza a menudo que contiene fenol y cloroformo en una relación en volumen de 1: 1, alcohol isoamílico en una relación en volumen de 1:24 con respecto al resto los componentes, y se saturan con TE pH 8,0 (Tampón de Tris-hidroximetil-aminometano que contenía EDTA 1 mM (etileno diamina tetraacetato)). El fenol desnaturaliza las proteínas y cloroformo con prontitud Se disuelve el fenol, que tiene una solubilidad limitada en agua. Cuando el ácido nucleico preparación se agita a fondo con el compuesto descrito y posteriormente centrifugados, proteínas desnaturalizadas se centrarán en la frontera de fase superior e inferior de fenol-cloroformo mayor densidad acuosa. alcohol isoamílico reduce la formación de espuma asociada con la separación procedimiento.

  • La adición de etanol a la fase acuosa que contiene el plásmido será causar la precipitación de ADN plasmídico, que puede ser tan posteriormente sedimentado por centrifugación.

  • El precipitado que contiene el ADN plásmido se lavó con etanol 70% en Para borrar el contenido de la preparación de la sal.

  • El ADN plásmido se sedimentó por tiempos de centrifugación, y luego disuelto en solución TE (véase el punto (s) de la composición). la preparación se puede almacenar sobre hielo o en un congelador. La solución también puede TE contener enzima DNasa libre de RNasa para eliminar ribonucleico ácidos.

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