Diferenciación de células madre embrionarias estudiados por espectroscopia FT-IR

Química Admin Octubre 29, 2016 0 23
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células madre embrionarias (ES) son un tipo de células auto-renovación que sólo puede conducir a la cultura ectodérmico, endodérmico, mesodérmico y capas germinales, imitando la embriogénesis [1], [2] y [3].

células ES

potencialmente puede generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, lo que los hace excelentes candidatos para terapia de reemplazo de célula y tejido, con un gran potencial para el cribado farmacéutico y el trasplante en una amplia gama de terapias [4]. Las células madre embrionarias se derivan de la masa celular interna de los mamíferos de blastocisto y se pueden propagar en cultivo en un estado indiferenciado. Cuando se estimula adecuadamente, pueden ser inducidas a diferenciarse en las poblaciones más especializados selectivamente. Por ejemplo, esto se puede lograr in vitro mediante la transferencia de las células en placas no adherentes en los que se forman estructuras diferenciadas espontáneamente llamados cuerpos embrioides (EBS) [5] (para una revisión, véase [6]).

La comprensión de las vías de desarrollo mediante el cual las células embrionarias se diferencian en diferentes tipos de tejido es crítica para aprovechar su potencial terapéutico. Con este fin, será útil para desarrollar nuevas herramientas tecnológicas para estudiar la diferenciación de las células ES en el modo de no-tiempo. De hecho, para supervisar los procedimientos largos actual estado de diferenciación de las células madre embrionarias cultivadas son necesarios, lo que indica la necesidad de una prueba rápida y sencilla.

En esta perspectiva, espectroscopía infrarroja por transformada de fourier (FT-IR) ha demostrado ser una herramienta poderosa para detectar cambios en el contenido macromolecular de células enteras, a través de la absorción de radiación electromagnética en el medio de infrarrojos (de 4000 a 400 cm - 1 números de onda) [7], [8], [9], [10], [11] y [12]. En particular, el nuevo multivariable analiza la evolución [13] que permite análisis más eficiente del espectro complejo, se obtuvo información importante en la biología celular y la medicina [14], [15] y # xA0; y [16]. Recientemente, estos enfoques se han aplicado con éxito al estudio de la diferenciación de células madre a partir de un número de grupos de investigación [17], [18] y # xA0; y [19]. Curiosamente, la espectroscopia FT-IR también puede contribuir a la caracterización de sustratos para el crecimiento de las células madre y etiquetado [20], [21] y [22].

continuación, describimos el uso de microspectroscopy FT-IR, junto con el análisis multivariante para el examen de la absorción infrarroja de las células ES murinas con el fin de identificar su estado de desarrollo in situ posible a través de los cambios en su contenido macromolecular durante la diferenciación. Este enfoque es rápida, no destructiva y permite examinar la expresión de varios marcadores simultáneamente en una sola medición de absorción.

Entre las otras técnicas espectroscópicas no invasivos, Raman microspectroscopy recientemente se ha aplicado a la estudio in situ de las células ES [23] y [24]. Estos autores fueron capaces de obtener información importante sobre la diferenciación de las células madre embrionarias por la respuesta de las bandas Raman de ácidos nucleicos. El estudio microespectroscopía infrarrojos informe que aquí está en excelente acuerdo con la investigación de células madre embrionarias Raman, un logro significativo ya que estas dos técnicas están investigando en realidad las propiedades vibracionales de células madre embrionarias a partir de diferentes interacción con la radiación electromagnética.

Además

, hay que señalar que la espectroscopia de infrarrojo en la región de amida I (1700-1600 cm - 1) es muy sensible a la estructura secundaria de la proteína que puede ser determinado para las proteínas en solución [25] y # xA0; y [26], dentro de las células intactas [27], [28] y [29], tejidos y organismos enteros [30] y [31]. En este trabajo, hemos aprovechado este potencial de la espectroscopia infrarroja para evaluar no sólo el contenido total de proteínas de las células madre embrionarias, sino también la estructura secundaria de las proteínas expresadas durante la diferenciación.

microespectroscopía

Por FT-IR hemos demostrado que, utilizando un número limitado de células intactas (aproximadamente 104 células), se puede controlar la evolución temporal de la diferenciación de células ES como es. A través del análisis multivariado de espectros ES diferenciación celular, hemos sido capaces de identificar los cambios espectrales más importantes que se producen en las proteínas y en las regiones de absorción de los ácidos nucleicos. El apoyo de los ensayos biológicos nos ha permitido asignar los cambios observados en la posición de la banda y la intensidad de los eventos moleculares específicos que tienen lugar durante ES cytodifferentiation.

2. Materiales y métodos

2.1. cultivo de células ES

células madre embrionarias murinas no diferenciadas

fueron cultivadas en una capa de alimentación STO de mitomicina C (Sigma-Aldrich, Italia) inactivado (un regalo del doctor Marina Morigi, Instituto Mario Negri de Investigaciones Farmacológicas, Bérgamo) (fase 1) a continuación, se pasaron a matraces T75 recubiertos de gelatina (fase 2), los dos pasos en Knockout DMEM suplementado con suero ESC 20% cualificado fetal bovino, 2 mm L-glutamina, 1- solución de aminoácidos no esenciales, solución de penicilina 0,5% -streptomicina (Invitrogen), 0,1 mM beta-mercaptoetanol (Sigma) y 500 U / ml de factor inhibidor de leucemia (LIF ESGRO-, Chemicon International). Los puntos 1 y 2 se repitieron para mantener las células ES no diferenciadas. Las células ES se pasaron cada 2 días enzimáticamente usando 1- solución de tripsina-EDTA (Invitrogen) y se mantuvieron en un termostato a 37 ° C y 7,5% de CO2. Antes del análisis de espectroscopia FT-IR, las células ES indiferenciadas se cultivaron durante 3 pasajes en matraces T75 recubiertos con gelatina en un medio completo, para evitar la contaminación STO.

2.2. la diferenciación de células ES

Después de tres pasajes en matraces recubiertos de gelatina, las colonias se disocia a una única suspensión celular y se sembró en nuevos matraces T75 recubiertos de gelatina en un medio sin LIF, ES, que fue cambiado cada 2 días para inducir la diferenciación espontánea. Después de placas, se recogieron las células ES diferenciadas y se prepararon para el análisis FT-IR en los días 4, 7, 9 y 14. Se realizó un total de tres experimentos independientes.

2.3. formación del cuerpo embrionario

cuerpos

embrionarias (EBS) se forman a partir de aproximadamente 2 - 103 ES células utilizando el método de la gota (para una explicación más detallada, véase [32], [33] y [34]). EBs se recogieron en los días 2, 4 y 7 días de diferenciación.

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