Inmunotinción: trucos y consejos para trabajar con células en cultivo

Química Admin Diciembre 14, 2016 0 2
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Los investigadores que llevan a cabo la inmunotinción frente a una serie de obstáculos técnicos, que puede ser la diferencia entre conseguir imágenes nítidas e información, un revoltijo o ninguna señal en absoluto ... " dice Nancy Kedersha, instructor de medicina en la Escuela Med Harvard y director de la Unidad de Microscopía Confocal del Hospital Brigham and Women 's. "Lo peor de todo, el resultado podría ser algo que parece muy específica, pero es engañosa o simplemente mal."

En este invitado entrada del blog, Nancy ofrece su asesoramiento experto en inmunohistoquímica y pone de relieve los aspectos a considerar en la planificación de sus experimentos de imagen usando células cultivadas ...

Encontrar el ambiente de trabajo adecuado ... (También conocido como ..., optimizar la memoria intermedia).

Los anticuerpos están optimizados por el sistema inmune para trabajar en un ambiente rico en sodio en la sangre - ¿por qué salina tamponada con fosfato (PBS) es por lo general la elección de tampón para la tinción de la superficie celular. Sin embargo el medio ambiente intracelular de potasio predominar , y se deben hacer esfuerzos para recrear estas condiciones.

"El sistema tampón utilizado durante las incubaciones y lavados después de la fijación (véase más adelante) y permeabilización puede hacer una gran diferencia para señalar tampón de fuerza tales PHEM o CSK se han desarrollado para su uso en células permeabilizadas, no fijadas en pruebas de funcionalidad basan en;. Estos tampones pueden ser utilizados en células fijadas y permeabilizadas en lugar de PBS, y son particularmente útiles con citoesqueleto o antígenos citoplasmáticos.

"En términos de intensidad de la señal (y en base a mi experiencia más), alrededor del 10% de los antígenos celulares significativamente mejor mancha en PHEM tampón PBS, el 50% moderadamente mejor lugar en PHEM y 30% de tampón no muestran ninguna diferencia. La restante 10% mucho mejor mancha en PBS! Así que trate de regular tanto PHEM y PBS utilizando un anticuerpo por primera vez. también hay una selección de otro tampón es posible que desee experimentar (ver cuadro 1) "

Elige el mejor fijador ... (... Para su combinación antígeno-anticuerpo.)

La naturaleza de los protocolos de inmunohistoquímica plantean otros retos además de cambiar el ambiente de trabajo óptimo: mantenga lo más intacta posible en todas estas células incubación y el lavado es una prioridad. En este caso, el ajuste es un paso crítico; su finalidad es la de mantener la estructura celular más cercana posible en el estado nativo. Una vez establecido, se puede proceder con el protocolo de tinción sin perder la proteína de interés, o incluso el resto de la célula. Fijación, sin embargo, destruye los sitios antigénicos, así que ten en cuenta que diferentes combinaciones de antígeno-anticuerpo pueden funcionar incorrectamente con un fijador, pero muy bien entre sí. En la determinación de los procedimientos de tinción para un nuevo objetivo, en particular, la ubicación incierta, o cuando se trabaja con un nuevo anticuerpo, usted debe tratar diferentes condiciones tanto de la fijación y tampones para encontrar el equilibrio correcto de la unión del anticuerpo y la integridad estructural .

"Hay dos clases de fijadores populares para elegir: fijadores de aldehído y disolventes orgánicos . Cada clase tiene sus ventajas y desventajas, de modo que cuando se trata de un nuevo anticuerpo o de destino no está bien caracterizado probar más de un método.

" la fijación de aldehído , utilizando compuestos de glutaraldehído o formaldehayde, las proteínas a los elementos del citoesqueleto y citoesqueleto entre ellos de reticulación. Así que este es el método de elección para el doble etiquetado de los antígenos unidos a la membrana y citoesqueleto. Sin embargo, este método proteínas modificadas químicamente, lo que potencialmente puede destruir antígenos. Esto no es generalmente un problema cuando se fija células (protocolos de células de fijación típica usando 2-4% de paraformaldehído durante 10-20 minutos), pero la fijación de aldehído de tejido requiere tratamientos muy largos para permitir la penetración de la muestra - que puede alterar la estructura de la proteína. Evitar tiempos de fijación prolongada tanto en las células y tejidos se recomienda cuando se utilizan aldehídos en el que puede hacerlo. Utilice aldehído también puede requerir un paso llamado ' endurecimiento 'que reduce la autofluorescencia (fijadores aldehídos reaccionan con aminas y proteínas para producir productos fluorescentes.)

" disolventes orgánicos , tal como metanol, etanol y acetona, no alteran de forma covalente las proteínas objetivo; En esencia, se precipitará las proteínas de la solución de un mantenimiento "cáscara" proteína, pero '' aplanamiento células como la solubilidad de la proteína se reduce. Esto hace más difícil la penetración nuclear y mitocondrial, y también elimina las proteínas de lípidos ligados tales como el contenido de lípidos no está protegido. Sin embargo, este método puede ser ventajoso para su uso con algunos anticuerpos (en particular, algunos anticuerpos monoclonales que se unen a un único epítopo) que afectan a los antígenos de curso enterrado dentro de la proteína interna structures.It es el método de elección para la conservación y citológico adecuado para la coloración del citoesqueleto ".

Una nota sobre el formaldehído

Las personas a menudo confunden los términos del formaldehído, paraformaldehído y formalina. El formaldehído es CH2O, el aldehído más simple. Paraformaldehído es efectivamente formaldehído polimerizado y viene en forma de polvo que requiere calentamiento en una campana de extracción para disolver. Una vez hecho es lento para penetrar en las células, y por lo general no permeabilizar lo suficiente por los anticuerpos para acceder al interior de las células. A menudo se requiere una permeabilización paso secundario (véase más adelante).

"Formalina es un líquido que contiene 37% de formaldehído, y por lo general tiene 10 a 15% de metanol añadido para evitar formaldehído polimerización. Presta atención a la presencia de metanol en formalina por las razones descritas en la sección anterior disolventes orgánicos. Un protocolo requiere 10 % de formalina es más o menos equivalente al 4% de formaldehído y también contiene metanol suficiente para permeabilizar las células parcialmente, pero no lo suficiente como para hacerlo de una manera consistente a menos que la fijación se lleva a cabo durante un largo período. "

Para resolver o no resolver ... (En el caso de células de reparación?)

La fijación puede dañar o enmascarar sitios antigénicos, comprometiendo así la intensidad de su inmunotinción. A veces puede ser vale la pena experimentar con la adición del anticuerpo antes o incluso sin fijación. Este enfoque es particularmente relevante para las proteínas expuestas en la superficie celular (véase la figura 1), a continuación, antes de identificar si el objetivo es aquí o no, simplemente añadiendo el anticuerpo al medio de cultivo. Proceder con cautela; muchos de moléculas de superficie celular se internalizan todo el tiempo, o cuando internalizar reticulado (son anticuerpos bivalentes y así puede servir para facilitar este!) Además, algunos antígenos implicados en la adhesión célula-célula puede ser funcionalmente afectadas por unión del anticuerpo. "

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