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Autor: Admin
Puntos de vista: 9
Hora: 20:10:38 | 1 año hace

La unión de cloroformo anestésico volátil albúmina demostró usando fluorescencia de triptófano temple

Este estudio muestra que la fluorescencia extinción proteína intrínseca triptófano se puede utilizar para monitorizar la asociación General de cloroformo anestésico volátil. Esto permite calcular la complejación de energía y proporciona una estimación la posición de la anestesia en la matriz de proteína. Además, en combinación con el trabajo previo (11), los resultados indican que el cloroformo se une a sitios de BSA y HSA ocupados por halotano. Aunque estudios previos utilizando ensayos de competición han sugerido que los anestésicos volátiles diferentes pueden unirse al mismo sitio en una proteína (7, 9, 11), esta es la primera demostración de tal uso de un enfoque directo para controlar la formación del complejo. Esto indica que las hendiduras, surcos o cavidades de la albúmina son lo suficientemente grandes, o flexible, para acomodar tanto cloroformo (volumen molecular = 102 A3 utilizando los volúmenes atómicos característicos de Abraham y McGowan (37)) y halotano (volumen molecular = 123 A3). Esto plantea la posibilidad de que puede haber también dominios de unión similares de las proteínas del sistema nervioso central que son el lugar (s) real de acción de los anestésicos generales volátiles.

La disminución de la unión de cloroformo a la parcialmente desnaturalizado BSA en presencia de 50% de 2,2,2-trifluoroetanol en comparación con la unión a la forma nativa de BSA pH 7,0 que indica que las características estructurales de la proteína son críticos terciaria para la creación de un dominio de unión apropiado. La importancia de la estructura terciaria para la creación de la unión anestésico sitios ha sido implicado en estudios previos utilizando halotano como el aglutinante (11, 12, 38, 39). Los estudios sobre el CD BSA en presencia de cloroformo indican que el enlace no está asociado con un anestésico sustancial cambios estructurales, de acuerdo con los resultados previos obtenidos usando halotano (11). Esto es consistente con otros estudios sobre más interacciones ligando-receptor convencionales (40,41) que muestran los cambios estructurales menores en estas proteínas de complejos ligando.

Experimentos

con mioglobina demuestran además que la unión de la proteína cloroformo dependiente de la conformación. mioglobina También contiene dos triptófano (27). Sin embargo, los entornos de los dos anillos de indol en la mioglobina aparentemente no favorecen la unión de cloroformo con suficiente la proximidad o la concentración para cumplir con la fluorescencia de triptófano. Esto concuerda con el trabajo previo (11), que no hayan mostrado una asociación entre halotano y la mioglobina.

El alto grado de atenuación de la fluorescencia de BSA cloroformo Desde la partición de la anestesia en el hidrofóbica dominios en la zona del anillo de indol. Subdominio IIA (que contiene Trp-214) se sabe que se une un número de ligandos hidrófobos como la warfarina y la bilirrubina (42). El enfriamiento rápido de la libre L-triptófano en metanol en la Fig. 4 muestra que a concentraciones suficientemente altas, el grado de extinción de la fluorescencia observada en la figura 2 para una BSA se puede lograr. Esta alta concentración aparente de cloroformo en la matriz proteica se atribuye a la favorable la interacción de la energía anestésico de la proteína y el impedimento estérico para la disociación de los impuestos residuos de triptófano polipéptido a partir de los alrededores. Los estudios de vida de fluorescencia muestran que el cloroformo extingue la fluorescencia del triptófano albúmina principalmente a través de un mecanismo de estática, lo que indica que el anestésico en realidad se une a la proteína.

la afinidad de unión promedio de los dos sitios de BSA según lo informado por extinción de la fluorescencia intrínseca del triptófano es 2,7 ± 0,2 mm. El sitio de Trp-134 disolventes más expuestos aparentemente tiene una afinidad con un K ligeramente más alto d = 1,5 ± 0,1 mm. Un estudio preliminar sobre la afinidad de cloroformo durante BSA utilizando un enfoque de competencia ha producido un K i = 1,3 ± 0,1 mm (9), en buena concordancia con este resultado. Las constantes de cierto vínculo en el presente y en el estudio anterior (9) son comparables a la concentración EC50 clínica para el cloroformo en los perros de 1,2 ± 0,2 mm (1, 43), lo que sugiere que los dominios de unión de BSA anestesia pueden tener características estructurales que imitan el sistema nervioso central los sitios de acción de los anestésicos generales, que permanecen a ser descritas. La albúmina puede entonces servir como un fácilmente disponibles de modelo de proteínas de mamíferos para el estudio de las características estructurales de los complejos de anestésico-proteína hasta una información más relevante de un vivosite (s) de la acción de los anestésicos volátiles generales que esté disponible.

El mecanismo de extinción de la fluorescencia de triptófano cloroformo no está clara, pero puede implicar la transferencia de electrones (29, 30) a partir de indol emocionados por el anestésico. Si el mismo mecanismo está funcionando en el caso de los residuos de triptófano situado en proteínas diferentes entornos queda por determinar. Además, átomo pesado alteración secundaria a átomos de cloro de la anestesia pueden jugar un papel, lo que conduce a un aumento de cruce entre sistemas (44). El mecanismo es de importancia, ya que puede definir la proximidad cloroformo para residuos de triptófano.

hay que señalar que los cambios estructurales inducidos anestésicos BSA pueden causar la extinción de la fluorescencia por mecanismos que hacen No se trata de un estrecho contacto entre el triptófano y cloroformo. Una variedad de grupos químicos presentes en proteínas (incluyendo histidina, cisteína, prolina, arginina, y el enlace peptídico) son capaces de temple triptófano fluorescencia (29, 45), si los cambios estructurales alteran su proximidad al anillo de indol. Sin embargo, cloroformo (hasta 25 mm) no tiene efecto sobre el espectro de CD ultravioleta lejano de BSA, lo que indica una falta de grandes cambios estructurales secundarios. este resultado Se sugiere que el cloroformo interactúa con BSA de modo que no implica extensa interrupción del enlace de hidrógeno. Es, sin embargo, no se puede descartar la contribución de los cambios estructurales más sutiles en la extinción de fluorescencia de proteína observada. De hecho, el hallazgo de que los anestésicos volátiles revertir la naturaleza quiral del enlace al sitio IIA subdominio (46) bilirrubina es probablemente el resultado de un cambio estructural local.

En resumen, la anestesia de cloroformo se une a la albúmina sérica volátiles en un saturable y reversible o cerca de los sitios ocupados por anestesia con halotano. Los resultados sugieren que tanto Trp-134, Trp-212 son parte de la cloroformo dominios de unión, como se informó anteriormente para halotano (10, 11), y representan la resolución máxima a la que se han descrito tales sitios de unión para el cloroformo para BSA. Este es el el primer estudio en demostrar que las aves que no sean los anestésicos generales pueden unirse al mismo sitio en una proteína en solución, proporcionar apoyo experimental para la hipótesis de que estos estructuralmente diferentes fármacos pueden actuar en sitios similares en las proteínas en el sistema nervioso central.

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